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E+ Rosetta（gamiB）感受態(tài)細胞說(shuō)明書(shū)

（Rev.A）

保存：-80℃保存，運輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-80℃保存至少6個(gè)月。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本公司生產(chǎn)的E⁺Rosetta（gamiB）感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌Rosetta（gamiB）菌株經(jīng)特殊工藝制備得到，具有無(wú)需繁瑣的冰浴、熱擊程序，簡(jiǎn)單快速的進(jìn)行質(zhì)粒DNA的轉化。使用pUC19 質(zhì)粒檢測，轉化效率最高可達 2×10⁷cfu/μg，-80℃保存3-5 個(gè)月轉化效率不發(fā)生改變。

基因型: F-ompThsdSB(rB- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) pRARE (argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL) (CmR)

特 點(diǎn): 一種用于鋪制與培養質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷的抑制型菌株。其φ80 lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與 pUC 載體編碼的 β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現 β 互補，可用于藍白斑篩選。

操作方法：（以下操作均按無(wú)菌條件的標準進(jìn)行）

1.     將感受態(tài)細胞置于冰上融化，以下實(shí)驗以 100μl感受態(tài)細胞為例。

2.     向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉化的目的 DNA，注意目的 DNA 的體積不要超過(guò)感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。

3.     室溫靜置5-10min。

4.     向離心管中加入 900μl 無(wú)菌無(wú)抗的 SOC（本試劑盒提供） 或 LB 培養基，37℃ 180rpm 振蕩培養 30分鐘到1小時(shí)。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

5.     取適量已轉化的感受態(tài)細胞涂布含相應抗生素的 SOC 或 LB 平板，37℃倒置培養 12-16小時(shí)或過(guò)夜培養。涂布用量可根據具體實(shí)驗來(lái)調整，如轉化的 DNA 總量較多，可取200μl 左右的轉化產(chǎn)物涂板；反之，如轉化的 DNA 總量較少，可4℃，2500g離心5min后，棄去上清約700μl，用剩余約200-300μl 的轉化產(chǎn)物涂板。過(guò)多菌液可以抑制細菌生長(cháng)。如果預計的克隆較少，可通過(guò)離心后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。

注意事項：

1.     感受態(tài)細胞應保存在-80℃，不可反復凍融，否則其轉化效率將會(huì )降低。

2.     實(shí)驗過(guò)程中應嚴格無(wú)菌操作，防止其它 DNA 或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。

3.     轉化時(shí)，轉化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源 DNA 量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì )降低轉化效率。轉化時(shí) DNA 體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分之一。

4.     轉化率的計算：轉化率＝產(chǎn)生菌落的總數/鋪板 DNA 總量。

5.     為防止轉化實(shí)驗不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉化，將損失降到最低。