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DH10Bac 感受態(tài)細胞說(shuō)明書(shū)

（Rev.A）

保存：-80℃保存，運輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-80℃保存至少6個(gè)月。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細胞是經(jīng)特殊工藝制備的，適用于昆蟲(chóng)桿狀病毒Bac-to-Bac系統中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組Bacmid。使用pFastbacHTA質(zhì)粒檢測，轉化效率最高可達2×10⁷CFU/ug，-80°C 保存幾個(gè)月轉化效率不發(fā)生改變。

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara,leu)7697 galUgalK λ- rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124

產(chǎn)品特點(diǎn)：
DH10Bac 細胞包含親本Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124。親本Bacmid包含一個(gè) mini-F 復制子、卡那霉素抗性基因、 Tn7 位點(diǎn)和 lac Z α-互補因子。att輔助質(zhì)粒包含tns ABCD 區域，該區域提供了 mini-Tn7從供體質(zhì)粒插入親本Bacmid靶位點(diǎn)所需要的轉座蛋白。供體如pFastBac系列質(zhì)粒（pFastBac1，pFastBac Dual等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂，Tn7R 和 Tn7L 之間包含慶大霉素抗性基因、昆蟲(chóng)病毒多角體基因啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和 SV40 病毒的PolyA加尾信號。當含有靶基因pFastBac的重組質(zhì)粒轉化到 DH10Bac 細胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組Bacmid，提取純化重組Bacmid轉染昆蟲(chóng)細胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲(chóng)病毒。

此外，DH10Bac 細胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的產(chǎn)物可以實(shí)現β-半乳糖苷酶的α-互補現象，用于重組bacmid的藍白斑篩選。

操作步驟（以下操作均按無(wú)菌條件的標準進(jìn)行）：
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：50 μg/ml kanamycin、7 μg/ml gentamicin、10 μg/ml tetracycline、100 μg/ml X-gal、40 μg/ml IPTG。
1.  取感受態(tài)細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無(wú)菌預冷的離心管中，置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100 μl，可以根據實(shí)際情況分裝使用。應注意所用 DNA 體積不要超過(guò)感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗以 100 μl感受態(tài)細胞為例。
2.  向感受態(tài)細胞懸液中加入 1-10 ng 重組質(zhì)粒，輕輕旋轉離心管以混勻內容物，在冰浴中靜置 30 分鐘。
3.  將離心管置于 42 ℃水浴中放置 90 秒，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻 2 分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。
4.  向每個(gè)離心管中加入 900 μl無(wú)菌的 SOC（不含抗生素），混勻后置于 37 ℃ 200 rpm，搖床振蕩培養 4 小時(shí)。
5.  用 SOC 培養基進(jìn)行 10 倍梯度稀釋?zhuān)绶殖?/span> 3 個(gè)稀釋梯度 10^-1, 10^-2, 10^-3
6.  取 100 μl的各個(gè)梯度的培養物用于涂布。等平板中的液體完全吸收后，倒置平板，37℃培養 24-48 小時(shí)。
7.  保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，視平板上菌落生長(cháng)情況決定去留。

相關(guān)試劑及培養基的制備方法:
1. SOB 和 SOC 培養基：稱(chēng)取 20g 胰蛋白胨，5g 酵母粉，0.5g NaCl置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去離子水，完全溶解后再補加 10ml 250 mMKCl溶液，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調 pH 值 7.0。加入去離子水將培養基定容至 1L。121℃高溫高壓滅菌15min。使用時(shí)加入 5ml 滅菌的 2M MgCl₂溶液（此種培養基稱(chēng)為SOB）。再補加經(jīng) 0.22 μm過(guò)濾除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此種培養基為 SOC）。
2. 轉化復蘇細菌用的液體 SOC 培養基：可以一次高壓 50ml 液體培養基，無(wú)菌狀態(tài)按 1ml 每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中，裝于自封袋中，凍存于-20℃中，每次用一支?？梢詷O大地避免培養基污染和減少勞動(dòng)量。
3. LB 固體選擇培養基：100ml LB 液體培養基中加入 1.5 g 瓊脂粉，搖勻后，121℃高壓滅菌 20 分鐘。冷卻至 50℃左右時(shí)加入相應濃度的抗生素（如氨芐青霉素，濃度通常為 100μg/ml），混勻后倒在細菌用的無(wú)菌培養皿中，等瓊脂凝固后即可使用。
4. IPTG：稱(chēng)量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 滅菌水，濃度為 200mmol/L。用無(wú)菌 0.22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。小份分裝后，-20℃保存。
5. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20 mg/ml，小份分裝（1 ml/份）后，-20℃避光保存。

注意事項：

1.     感受態(tài)細胞應保存在-80℃，不可反復凍融，否則其轉化效率將會(huì )降低。

2.     實(shí)驗過(guò)程中應嚴格無(wú)菌操作，防止其它 DNA 或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。

3.     轉化時(shí)，轉化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源 DNA 量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì )降低轉化效率。轉化時(shí) DNA 體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分之一。

4.     轉化率的計算：轉化率＝產(chǎn)生菌落的總數/鋪板 DNA 總量。

5.     為防止轉化實(shí)驗不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉化，將損失降到最低。