嘔吐毒素又稱(chēng)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，是單端孢菌素烯烴中的一種，其通常是由生長(cháng)在谷類(lèi)物品(如小麥、玉米、大麥和秣草)霉菌鐮紅菌素生成的。嘔吐毒素DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類(lèi)作物，也污染糧食制品，人、動(dòng)物在誤食被嘔吐毒素污染的糧食谷物后可能產(chǎn)生廣泛的毒性效應。近年來(lái)發(fā)現，嘔吐毒素DON可能與人類(lèi)食管癌、IgA腎病有關(guān)，對人類(lèi)、動(dòng)物的健康均構成威脅。人畜攝入了被嘔吐毒素DON污染的食物／飼料后，會(huì )出現厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩、反應變得遲鈍等急性的中毒癥狀，嚴重時(shí)可損害造血系統造成死亡。研究表明，嘔吐毒素DON可能對免疫系統有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無(wú)致癌、致突變作用。由于嘔吐毒素DON的危害嚴重，引起了各國的普遍重視。谷物及飼料中嘔吐毒素DON的含量有嚴格的限量標準。我國谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料、泌乳期動(dòng)物配合飼料中嘔吐毒素DON的限量標準為1.0mg／kg，牛配合飼料、家禽配合飼料中嘔吐毒素DON的限量標準為5.0mg／kg。

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：嘔吐毒素檢測儀、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗結果。

5.2 配液：

配液1：復溶液

    將2×復溶液用去離子水2倍稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹腿?，復溶液?℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物（大米、玉米、小米等）及飼料處理方法

1）稱(chēng)取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml去離子水，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取0.1ml上清，加入0.9ml復溶液，混勻；

3）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數：50    檢測下限：150ppb

6 嘔吐毒素檢測儀酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì )有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實(shí)驗開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(gè)樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品應用液或樣本50?l/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50?l/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應：加酶標記物100?l/孔，37℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50?l/孔，再加底物液B 50?l/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：加終止液50?l/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用CSY-E96D嘔吐毒素檢測儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長(cháng)450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

 百分吸光度值（%）＝

A

×100%

A0

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線(xiàn)的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來(lái)電索?。?/p>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì )導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現板孔干燥的情況，則會(huì )出現標準曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線(xiàn)照射。

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

閱讀：  2019-06-25 17:43:38