細胞凍存和復蘇可以：（1）用于生物學(xué)保種；（2）用于醫學(xué)上干細胞研究；（3）用于傳代培養

實(shí)驗方法原理

細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時(shí)間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

實(shí)驗材料

細胞

試劑、試劑盒

D-Hanks液小牛血清培養液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油

儀器、耗材

微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數板記號筆醫用橡皮膏移液槍超凈工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養箱液氮冰箱

實(shí)驗步驟

一、材料準備

1.  儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。

2.  玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3.  塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4.  其他物品：微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、醫用橡皮膏、移液槍。

5.  試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油。

二、細胞凍存

1.  配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液。

2.  取對數生長(cháng)期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長(cháng)的細胞消化下來(lái)，懸浮生長(cháng)的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

3.  離心1 000 rpm，5 min。

4.  去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5.  將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

6.  在凍存管上標明細胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者。

7.  凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

三、 細胞復蘇

1.  從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2.  從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻。

3.  離心， 1 000 rpm，5 min。

4.  棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養。

5.  次日更換一次培養液，繼續培養。

閱讀：  2016-12-13 13:09:04