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四唑鹽（MTT）比色法可以：（1）檢測細胞存活和生長(cháng)；（2）大規模的抗腫瘤藥物篩選；（3）細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定；（4）生物活性因子的活性檢測。
MTT法是Mosmann 1983年報道的，以后此方法得到了迅速發(fā)展并廣泛應用于臨床與科研研究。其原理是活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。
| 實(shí)驗材料 | 細胞樣品 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | PBS DMSO 胰蛋白酶甘 氨酸緩沖液 二甲亞楓 |
| 儀器、耗材 | 加樣器9 6孔培養板 酶標儀 培養板 |
| 實(shí)驗步驟 | 一、實(shí)驗前應明確的問(wèn)題 1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長(cháng)滿(mǎn)時(shí)約有105個(gè)細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行預實(shí)驗檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細胞數條件下的生長(cháng)曲線(xiàn)，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時(shí)間，以保證培養終止致細胞過(guò)滿(mǎn)。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線(xiàn)性關(guān)系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀(guān)察不到差異。 2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時(shí)間范圍再細篩。切記！否則，可能你 用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。 3. 時(shí)間點(diǎn)的設定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線(xiàn)，曲線(xiàn)什么時(shí)候變得平坦了（到了平 臺期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因為這個(gè)時(shí)候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。 4. 培養時(shí)間。200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來(lái)說(shuō)，很難維持68 h，如果營(yíng)養不夠的話(huà)，細胞會(huì )由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48 h換液的。
5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。 6. 理論未必都是對的。要根據自己的實(shí)際情況調整。 7. 實(shí)驗時(shí)應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。 8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì )影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會(huì )試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。 二、貼壁細胞 1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。 2. 5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿(mǎn)孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度，每孔100 ul，設3-5個(gè)復孔.建議設5個(gè)，否則難以反應真實(shí)情況。 3. 5% CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。 4. 每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。 5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。 6. 每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 7. 同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜） 三、懸浮細胞 1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將 （1）補足的1640（無(wú)血清）培養基40 ul ； （2）加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1：10-1：20）； （3）需檢測物10 ul； （4）細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設對照（加100 ul 1640）。 2. 置37℃，5% CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。 3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值） 4. 離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。 5. 同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。 四、MTT的配制 MTT一般最好現用現配，過(guò)濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(cháng)期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現配，直接往培養板中加，沒(méi)必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用了。 MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉. 配制MTT時(shí)用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。 1. PBS配方 （1）NaCl ：8 g。 （2）KCl 0.2：g。 （3）Na2HPO4 ：1.44 g。 （4）KH2PO4：0.24 g。 （5）調pH7.4。 （6）定容1 L。 五、細胞的接種（鋪板） 細胞過(guò)了30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復利用的板只可做預實(shí)驗。 接種時(shí)最好按照預實(shí)驗摸索出的密度接種， 因為細胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線(xiàn)性關(guān)系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會(huì )很明顯，太密細胞可能都會(huì )凋亡，因為細胞長(cháng)的太快營(yíng)養會(huì )不夠，最后導致死亡。且而細胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì )過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線(xiàn)性關(guān)系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。 細胞密度要根據不同細胞的特點(diǎn)來(lái)定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。 |
閱讀： 2016-12-12 09:23:37
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