蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動(dòng)物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。蛋白表達系統是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系，通過(guò)這個(gè)體系可以實(shí)現外源基因在宿主中表達的目的。

1、宿主。表達蛋白的生物體?？梢詾榧毦?、酵母、植物細胞、動(dòng)物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類(lèi)也不相同。

2、載體。載體的種類(lèi)與宿主相匹配。根據宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動(dòng)物表達載體、昆蟲(chóng)表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過(guò)載體介導，外源基因可以在宿主中表達。

3、輔助成分。有的表達系統中還包括了協(xié)助載體進(jìn)入宿主的輔助成分。比如昆蟲(chóng)-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。

一、大腸桿菌表達系統

在各種表達系統中，最早被采用進(jìn)行研究的是大腸桿菌表達系統，也是目前掌握最為成熟的表達系統。大腸桿菌表達系統以其細胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導表達相對簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)成為生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統。目前最常用的大腸桿菌表達系統為BL21-PET表達系統，此系統目前已經(jīng)商業(yè)化，并且普遍應用于各大實(shí)驗室和生物技術(shù)公司。

對于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動(dòng)子和有效核糖體結合位點(diǎn)序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現表達載體、帶伴侶的表達載體。

優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚；繁殖快、成本低、抗污染能力強；表達量高、表達產(chǎn)物分離純化相對簡(jiǎn)單、穩定性好；商品化的載體和菌株種類(lèi)非常齊全、適用范圍廣等。

缺點(diǎn)：

① 沒(méi)有真核轉錄后加工的功能，不能進(jìn)行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；

② 沒(méi)有真核翻譯后加工的功能，表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒(méi)有足夠的生物學(xué)活性；

③ 表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì )在細菌內聚集成包涵體，尤其當表達目的蛋白量超過(guò)細菌體總蛋白量10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。細菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無(wú)生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過(guò)復性，使其重新散開(kāi)、重新折疊成具有天然蛋白構象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。

④ 可能會(huì )產(chǎn)生一些致熱源(內毒素)，并且大腸桿菌本身含有內毒素和有毒蛋白，可能混雜在終產(chǎn)物里。

二、酵母表達系統

酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應用，應用此系統可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規模蛋白的強有力的工具。

常用的酵母表達系統有釀酒酵母表達系統和甲醇營(yíng)養型酵母表達系統。甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬應用最多。

優(yōu)點(diǎn)

1. 生長(cháng)方面：酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長(cháng)繁殖快速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產(chǎn)品時(shí)有效降低了生產(chǎn)成本。畢赤酵母具有強烈的好氧生長(cháng)偏愛(ài)性，可進(jìn)行細胞高密度培養，利于大規模工業(yè)化生產(chǎn)。

2. 安全性方面：釀酒酵母被認為是安全無(wú)毒的，有著(zhù)數十年的大規模發(fā)酵研究基礎。

3. 分子生物學(xué)操作方面：釀酒酵母在重組DNA中的廣泛研究也是基于其己被人們掌握的大量分子生物學(xué)及生理學(xué)信息。外源基因一般和表達載體一起整合到了酵母染色體上，隨染色體一起復制和遺傳，不會(huì )發(fā)生外源基因的丟失現象。

4. 蛋白表達方面：可以進(jìn)行蛋白的糖基化，而且還能分泌重組蛋白。

5. 蛋白分泌方面：由于畢赤酵母自身分泌到培養基中的蛋白很少，因此純化方便。

缺點(diǎn)

1. 克隆基因的表達量低，發(fā)酵時(shí)間長(cháng)，不正確的蛋白糖基化及抗細胞分裂。

2. 培養上清多糖濃度高，不利于純化。

三、昆蟲(chóng)表達系統

昆蟲(chóng)表達系統是一類(lèi)應用廣泛的真核表達系統，它具有同大多數高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉移外源蛋白的能力。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達系統是目前國內外十分推崇的真核表達系統。利用桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動(dòng)子構建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。它具有真核表達系統的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白；其最高表達量可達昆蟲(chóng)細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個(gè)感染昆蟲(chóng)細胞內同時(shí)表達多個(gè)外源基因的能力；對脊椎動(dòng)物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來(lái)源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質(zhì)粒來(lái)源于PUC系列，其含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)和多角體蛋白啟動(dòng)子。

桿狀病毒系統的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

1．組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配

2．蛋白翻譯后的加工修飾

3．表達水平高，可達總蛋白量的50%

4．可容納大分子的插入片段

5．能同時(shí)表達多個(gè)基因。

主要缺點(diǎn)是外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動(dòng)子的調控之下，這時(shí)由于病毒感染，細胞開(kāi)始死亡。

四、哺乳動(dòng)物表達系統

哺乳動(dòng)物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。哺乳動(dòng)物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。

根據目的蛋白表達的時(shí)空差異，可將表達系統分為瞬時(shí)、穩定和誘導表達系統。瞬時(shí)表達系統是指宿主細胞在導入表達載體后不經(jīng)選擇培養，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時(shí)限短暫;瞬時(shí)表達系統的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)捷，實(shí)驗周期短。穩定表達系統是指載體進(jìn)入宿主細胞并經(jīng)選擇培養，載體DNA穩定存在于細胞內，目的蛋白的表達持久、穩定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩定表達相對耗時(shí)耗力。誘導表達系統是指目的基因的轉錄受外源小分子誘導后才得以開(kāi)放。采用異源啟動(dòng)子、增強子和可擴增的遺傳標記，可提高蛋白產(chǎn)量。

哺乳動(dòng)物細胞表達系統常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH/3T3等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時(shí)應根據具體情況而定。

優(yōu)點(diǎn)

1. 蛋白活性：由哺乳動(dòng)物細胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲(chóng)細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細胞表達載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。

2. 哺乳動(dòng)物細胞表達外源蛋白的最大優(yōu)點(diǎn)是正確的高級結構（如糖基化）。

3. 哺乳動(dòng)物表達系統在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有獨特優(yōu)勢，適合表達完整的大分子蛋白。

缺點(diǎn)

培養基成本極高，培養周期長(cháng)，至少一個(gè)月以上，培養較困難，表達量較低。

構成復雜、操作技術(shù)要求高、表達產(chǎn)量不大、產(chǎn)率低，且有時(shí)會(huì )導致病毒感染

閱讀：  2016-06-24 08:54:31