隨著(zhù)生物技術(shù)的迅猛發(fā)展、基因工程技術(shù)已在農業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛運用。自二十世紀八十年代以來(lái)以基因改良為核心的農業(yè)生物技術(shù)正掀起第二次綠色革命。運用轉基因技術(shù)（Gene transfer）能培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲(chóng)害、抗逆的優(yōu)良品種，以緩解由于人口迅速增長(cháng)、可耕地的減少、資源短缺、環(huán)境惡化而帶來(lái)的農牧產(chǎn)品和食品短缺的危機。以農作物為例〔1〕自1994年第一例轉基因延熟西紅柿在美國批準上市以來(lái)，全球轉基因作物種植面積迅猛擴大，由1996年的170萬(wàn)公頃增長(cháng)到2002年的5870萬(wàn)公頃。轉基因作物產(chǎn)品的全球銷(xiāo)售額由1995年的0.75億美元、1999年激增到21～23億美元,預測2005年將達到80億美元，2010年將突破250億美元〔2〕。

轉基因農產(chǎn)品、食品的安全性問(wèn)題

1.轉基因農產(chǎn)品、食品引發(fā)的安全性思考

隨著(zhù)轉基因農產(chǎn)品、食品的迅猛增加，雖然其具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)，但由于轉基因農產(chǎn)品和食品是把一種外源基因片斷轉移到目的物種中，從而改變目的物種的性狀，特別是1998年發(fā)生的英國蘇格蘭Rowett研究所的Pusztai事件，雖后來(lái)被否定〔3〕，但接著(zhù)1999年又發(fā)生的美國康奈爾大學(xué)Losey等報道的帝王蝶〔4〕事件至今尚在進(jìn)一步驗證之中。而巴西堅果蛋白質(zhì)與其轉基因大豆對人引起類(lèi)似的過(guò)敏反應等事件，使人們對轉基因農產(chǎn)品、食品的安全性提出眾多質(zhì)疑，例如：外源基因是否安全? 基因結構是否穩定且會(huì )不會(huì )產(chǎn)生有害人體健康的突變?基因轉入后是否產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利健康成分? 營(yíng)養成分和其它功能性是否改變？轉基因的標記基因是否會(huì )使人產(chǎn)生抗藥基因? 是否會(huì )增加食物的過(guò)敏源〔5〕……消費者從自身健康考慮，提出轉基因食品安全問(wèn)題是非常自然的。轉基因食品的安全性問(wèn)題，已引發(fā)全球爭論，對轉基因食品這一新生事物做好安全性檢測和評估是非常必要的。 安全性評估主要包括有無(wú)毒性、有無(wú)過(guò)敏性以及抗生素抗性等標記基因的安全性。世界各國人們都在呼吁對轉基因食品進(jìn)行科學(xué)的評估。

2. 實(shí)質(zhì)等同性原則〔6〕

目前對食品安全性的評估均采用世界經(jīng)濟發(fā)展合作組織（OECD）1993年提出的實(shí)質(zhì)等同性原則，即通過(guò)生物技術(shù)得到的轉基因食品是否與目前市售常規食品有實(shí)質(zhì)性的等同：⑴生物技術(shù)食品與傳統食品有實(shí)質(zhì)性等同。由于經(jīng)過(guò)了長(cháng)期的自然選擇，機體已經(jīng)對該種物質(zhì)具有了良好的適應性，人類(lèi)和自然環(huán)境對其也已經(jīng)接受，對此類(lèi)產(chǎn)品可不必進(jìn)行安全檢測與評估。⑵轉基因產(chǎn)品與傳統產(chǎn)品除某一插入的特定性狀外，與非轉基因動(dòng)植物具有實(shí)質(zhì)等同性。對這類(lèi)轉基因產(chǎn)品的檢測應主要集中在對插入基因表達產(chǎn)物的檢測上，不必過(guò)分強調分析其他性狀，也不必考慮DNA和mRNA本身是否有毒性，因為所有生物體的DNA構件元素都是一樣的。⑶轉基因產(chǎn)品與傳統產(chǎn)品沒(méi)有實(shí)質(zhì)的等同性且市場(chǎng)上沒(méi)有與轉基因食品相對應的傳統產(chǎn)品，對該類(lèi)產(chǎn)品則要求進(jìn)行詳細的安全性檢測和評估，包括有無(wú)天然有毒物質(zhì)、有無(wú)營(yíng)養成分和抗營(yíng)養因子、有無(wú)過(guò)敏源、轉基因的穩定性和插入突變、基因的多效性和次級效應等。

3. 世界各國對轉基因食品的認識和態(tài)度

美國是轉基因食品的積極倡導者，美國公民對轉基因食品采取比較寬容的態(tài)度，其轉基因作物的播種面積一直占據全世界的首位。他們認為轉基因食品在上市之前要經(jīng)過(guò)嚴格的市場(chǎng)準入檢測，在實(shí)質(zhì)上和傳統的食品沒(méi)有什么區別即可上市。美國由FDA、EPA、USDA負責轉基因食品的評價(jià)、檢測和監控。這些機構與聯(lián)合國糧食組織（FAD）、世界衛生組織（WHO）和美國國家科學(xué)院（NAS）對新食品管理的原則是一致的〔7〕。

歐盟對轉基因食品持比較謹慎的態(tài)度，政府反對美國轉基因食品涌入自己的國家。他們認為轉基因食品通過(guò)生物技術(shù)將其他動(dòng)物、植物、微生物的一段異源基因不定點(diǎn)插入目的食品，打破生物種間的界限會(huì )破壞自然的食品構成體系，造成基因水平的混亂，可能會(huì )導致一些遺傳學(xué)或營(yíng)養成分的非預期改變，從而危害人們的健康。同時(shí)也認為轉基因食品的新組合和性狀在不同遺傳背景下表達，人們還缺乏其對環(huán)境、人類(lèi)影響的認識，加之應用于生產(chǎn)和消費的時(shí)間還很短，不能拿出足夠的證據來(lái)證明轉基因食品對人的身體是完全安全的。但其中也不乏帶有政治色彩的屬于貿易壁壘的抵制。歐盟1996年制定的食品標簽法規規定必須對轉基因食品進(jìn)行標簽標注。在管理上分橫向的與技術(shù)相關(guān)的法規和縱向的與產(chǎn)品相關(guān)的法規〔8〕。

中東一些國家由于宗教的影響從社會(huì )倫理方面考慮對轉基因食品比較排斥。南美、日本、韓國等屬于比較中立的國家對轉基因食品不像歐盟那樣排斥也不像美國那樣認可，他們都開(kāi)始了轉基因食品安全性的試驗研究。我國既積極支持轉基因技術(shù)的研究同時(shí)對對轉基因食品采取比較謹慎的態(tài)度，認同國際上通行的轉基因食品的實(shí)質(zhì)等同性原則。我國國家科委1993年頒布了《基因工程安全辦法》，1996年農業(yè)部正式實(shí)施《農業(yè)生物基因工程安全性管理法規》，對轉基因農產(chǎn)品從試驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放到最后的商品化全過(guò)程進(jìn)行安全性評價(jià)、并制定了相應的監督檢測措施。2002年3月，正式實(shí)施《農業(yè)轉基因生物安全評價(jià)管理辦法》和《農業(yè)轉基因生物標識管理辦法》。這些政策和法規的頒布與實(shí)施對人們食用轉基因食品提供了有力的保障?！?〕

轉基因食品的檢測方法

鑒于全世界對轉基因食品的安全性引起的關(guān)注和激烈爭論，對轉基因食品的檢測顯得尤為重要?；蚬こ碳夹g(shù)是將克隆的外源基因通過(guò)基因槍法、農桿菌介導法等方法轉入目的農作物中、使目的農作物中具有外源基因所具有的優(yōu)良性狀。對轉基因食品的檢測、從轉基因技術(shù)本身來(lái)分析、可從基因水平、基因轉錄水平和基因翻譯產(chǎn)物水平進(jìn)行。

1. 基因水平的檢測

轉基因技術(shù)將從各種生物中克隆出來(lái)的目的基因片斷插入到靶向受體中時(shí)，一般要構建啟動(dòng)子、終止子、選擇標記基因、報告基因等。從基因水平進(jìn)行轉基因的檢測就是要檢測受體的核酸序列、目的片斷的整合位點(diǎn)、基因多態(tài)性、目的片斷的含量分析以及啟動(dòng)子、終止子、選擇標記基因、報告基因等。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction） PCR法〔10〕

對報檢的樣品運用PCR儀，針對外源基因設計合適的引物，通過(guò)TaqDNA酶的聚合快速特異地擴增目的基因片段，使目的基因片斷以數量級速度在體外得到擴增從而可以在短短的幾小時(shí)內使Pg水平的特異外源DNA片段擴增到ng乃至ug水平，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酞胺凝膠電泳，用溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下就可觀(guān)察到外源目的片斷。

(1) 定性PCR法

定性PCR可直接檢測啟動(dòng)子、終止子、標記基因片斷、目的基因片斷。為使目的基因很好的進(jìn)行表達，在構建基因表達載體時(shí)常在目的基因的5’和3’端分別加上啟動(dòng)子和終止子。當前大約75%的轉基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S啟動(dòng)子，其次是胭脂堿和章魚(yú)堿合成酶的NOS啟動(dòng)子和Ocs啟動(dòng)子。常用的終止子是胭脂堿合成酶的NOS終止子和Rubisco小亞基基因的3’端區域、所以當前對啟動(dòng)子和終止子的檢測實(shí)際上是對Ca MV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的檢測。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而攜帶35S，故檢測出陽(yáng)性信號;而NOS終止子來(lái)源于普遍存在的農桿菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR對35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行檢測時(shí)應配合其他檢測。定性PCR受DNA抽提和純化的影響，如果DNA降解或受污染，檢測結果就會(huì )出現假陽(yáng)性現象；只能初步確定是否為GMF但不能鑒定是哪種GMF。

(2) 定量PCR法

在實(shí)際貿易和食品消費中我們不僅想知道食品是否是轉基因的，而且還想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR擴增過(guò)程中，以不同濃度標準陽(yáng)性樣品作參照，標準陽(yáng)性物用基因工程方法合成，上游引用熒光標記，下游引物不標記，在模板擴增的同時(shí)，標準陽(yáng)性物也被擴增。。最后根據吸光值作出吸光值與轉基因含量的標準曲線(xiàn)圖，以此可以確定檢測樣品的轉基因含量，這樣可以進(jìn)行半定量檢測。

(3) 定量競爭性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 

在PCR的反應管中，同時(shí)放入用人工合成用熒光標記的模板和待測樣品讓兩者對同一引物同時(shí)擴增，反應完成后通過(guò)測定熒光強度推測待測樣品的DNA含量。

(4) 實(shí)時(shí)定量熒光PCR法〔11〕

實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)是在常規PCR基礎上，添加一條熒光標記基因探針（一般為T(mén)aq man）。一個(gè)標記在探針的5'端，一個(gè)標記在探針的3'端，兩者構成能量傳遞結構，兩個(gè)熒光集團根據距離控制是吸收或抑制，在PCR不斷擴增中不斷檢測反應體系中熒光信號的變化，通過(guò)記錄循環(huán)次數和PCR體系中起始DNA量的對數值之間的線(xiàn)性關(guān)系確定起始DNA的量。用實(shí)時(shí)定量熒光PCR對轉基因食品進(jìn)行檢測可避免普通PCR反應過(guò)程中由于外界污染或樣品本身DNA降解等原因造成的假陽(yáng)性結果，但是實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀價(jià)格昂貴，檢測費用高。

(5)反轉錄RT-PCR法

 反轉錄PCR克服了待檢樣品中外源基因含量特別微量，以mRNA為模板反轉錄成cDNA，再通過(guò)PCR擴增進(jìn)行檢測。

(6) PCR—ELISA法

PCR一ELISA是I種將PCR高效性與ELISA高特異性結合在一起的轉基因檢測方法。利用共價(jià)交聯(lián)在PCR管壁上的寡核普酸作為固相引物，在Taq酶作用下，以目標核酸為模板進(jìn)行擴增，產(chǎn)物一部分交聯(lián)在管壁上，為固相產(chǎn)物，一部分游離于液體中，為液相產(chǎn)物。對于固相產(chǎn)物，可用標記探針與之雜交，再用堿性磷酸酷酶標記的鏈親和素進(jìn)行ELISA檢測，同時(shí)可通過(guò)凝膠電泳對液相產(chǎn)物進(jìn)行分析。將PCR和ELISA兩種方法相結合，可以相互取長(cháng)補短，使檢測的準確性大大提高。目前在我國尚未建立統一完備的轉基因食品的篩選方法，隨著(zhù)轉基因食品的數量增多及我國加入世界貿易組織，在我國建立轉基因食品的篩選方法將對人群健康及生態(tài)環(huán)境的保護起積極的作用。

Southern雜交

Southern雜交技術(shù)在分子生物學(xué)中用于基因組DNA特定序列定位。在轉基因食品中用Southern技術(shù)，是要在知道該轉基因食品轉入外源基因片斷的情況下使用。以放射性或熒光標記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農產(chǎn)品的總DNA進(jìn)行雜交。首先用限制酶消化受體總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉移至一固相支持體上。DNA轉移至固相支持體的過(guò)程中，各個(gè)DNA片斷的相對位置保持不變，用放射性或熒光標記的探針與各個(gè)DNA片斷雜交，經(jīng)放射自顯影確定與探針互補的電泳條帶的位置。Southern技術(shù)用于食品外源基因的檢測可檢測出外源基因與內源基因有高度同源性的DNA片斷，且準確可靠，但對樣品的純度要求較高，費用也較高。

基因芯片

基因芯片〔12〕是20世紀80年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項高新技術(shù)，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列的矩陣，基因芯片可以將目前通用的報告基因、抗性基因、啟動(dòng)子和終止子的特異片段(靶片段)固定于玻片上制成檢測芯片，將從待檢樣品中提取的DNA擴增、標記后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號由芯片掃描儀檢測，再經(jīng)計算機軟件進(jìn)行分析判斷,其基本原理為通過(guò)雜交檢測信號?；蛐酒夹g(shù)可對樣品進(jìn)行集約化和平行處理。利用基因芯片可實(shí)現對DNA的準確、快速、大信息量的檢測。從而方便、快速地對大量待檢測轉基因作物進(jìn)行靈敏、準確的檢測。        

其不足之處是每種檢測樣品首先必須有與之相配的非轉基因作物的芯片。

 2. 基因轉錄水平檢測

northern印跡雜交

將northern技術(shù)用于外源基因的測定可測定特定外源基因DNA的轉錄產(chǎn)物mRNA分子的大小和豐度。RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分開(kāi)，隨后將RNA轉移至活化纖維素、硝酸纖維素濾膜上。用放射性標記的外源DNA探針或RNA探針進(jìn)行雜交和放射自顯影，確定外源DNA的轉錄產(chǎn)物RNA。

3. 基因翻譯表達水平的檢測

1. 酶聯(lián)免疫吸附反應(EL ISA)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于檢測表達的目的蛋白，其基本原理是抗原抗體的特異性結合和酶對底物的高效催化。將針對目的蛋白的抗體包被在ELISA板上，加入待測物的溶液，經(jīng)保溫如待測物中含有轉基因片斷的表達產(chǎn)物即相應的蛋白，該蛋白作為抗原與包被的特異性抗體相結合。加入酶標記的針對目的蛋白的抗體，再經(jīng)保溫后加入酶反應底物顯色，以酶聯(lián)閱讀儀測定OD值。

2. 蛋白芯片

蛋白芯片的操作過(guò)程和基因芯片是一樣的，只是其原理是利用抗原抗體的特異性結合而不是堿基對的互補雜交。

3. Westertern印跡法

Western印跡法的原理和Southern雜交、northern印跡雜交的原理相似，是抗原抗體的特異性結合。把從樣品中提取的蛋白質(zhì)用凝膠電泳分離成大小不同的分子作為抗原，并將其轉移到固體支持物上，用含有放射性標記的抗體做探針與之雜交，通過(guò)放射性自顯影檢測外源基因的表達產(chǎn)物。Western印跡法與EL ISA所用都是抗原抗體的特異性結合，標記探針不同而已。一個(gè)為放射性標記，一個(gè)為酶標記。

轉基因食品檢測的發(fā)展方向和趨勢

由于轉基因食品直接關(guān)系到人們的身體健康和切身利益，所以對轉基因食品的檢測要求快速、準確、實(shí)用、操作簡(jiǎn)便。轉基因食品的檢測正朝著(zhù)試劑盒的方向發(fā)展，DNA芯片技術(shù)在未來(lái)的轉基因檢測中的作用也越來(lái)越突出。

閱讀：  2016-06-22 14:44:56