檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：
? 分析試驗應用的類(lèi)型
? 樣本蛋白的結構性質(zhì)
? 樣本的種屬
? 抗體宿主的種類(lèi)
? 抗體的標記和檢測

1.分析試驗應用的類(lèi)型   
一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過(guò)適用于何種分析類(lèi)型，如：可以應用于WB  IHC  ICC  ELASA分析等，如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應用類(lèi)型，并不意味著(zhù)該抗體不適用于此種分析應用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗驗證，如果抗體不適用某些分析試驗，則會(huì )在抗體說(shuō)明書(shū)上標注出來(lái)不適于某分析試驗。

2.樣本蛋白的結構性質(zhì)  
了解樣本蛋白的結構性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮
?待測樣本蛋白的結構域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(cháng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(cháng)的某一區域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。
?樣本的提取或處理過(guò)程：某些抗體要求樣本經(jīng)過(guò)某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時(shí)，應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修復解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì )在抗體說(shuō)明書(shū)上應用部分標示出來(lái)

3.樣本的物種
應選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類(lèi)未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應種屬表中，并不意味著(zhù)該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過(guò)，應通過(guò)序列比對的方法來(lái)預測交叉反應，可應用Expasy 和 NCBI BLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。

4.一抗宿主物種的選擇   
一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結合出現IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。

5.二抗的選擇
二抗應選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，例如：如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說(shuō)明書(shū)確保該抗體適用于你的檢測應用， 二抗一般連接熒光素FITC或發(fā)光團。

6.雙重染色抗體的選擇
用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細胞培養物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來(lái)源于不同物種并且二抗分別識別其中之一，二抗說(shuō)明書(shū)應描述其與其它物種來(lái)源的免疫球蛋有否有交叉吸附。

7.熒光和化學(xué)發(fā)光標記  
連接于二抗的標記物是為了檢測抗體的結合，選擇標記物依賴(lài)于幾個(gè)參數：
?檢測方法：
  熒光或著(zhù)色沉淀，熒光標記物用特殊波長(cháng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見(jiàn)光
?封片介質(zhì)（僅免疫組化）：
AEC, Fast Red, INT 或其它水性發(fā)光基團是可以醇溶的并要求水性封片. 除上述之外的發(fā)光基團是有機的所以最好使用有機性封片介質(zhì)。
熒光素標記物要求水性封片介質(zhì)，藻紅蛋白(藻青素 / 藻紅素要求不添加甘油的水性封片介質(zhì)，因其有淬滅熒光的效應，
?生物素化的抗體：
通常用于加強親和素-生物素-酶或熒光素復合物（ABC試劑或親和素或鏈霉親和素連接酶或熒光素的信號）

閱讀：  2016-06-01 13:46:29