摘要:為研究社會(huì )隔離能否導致雌性嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生焦慮，將成年雌性大鼠分別進(jìn)行單獨隔離飼養(單養)和四只一籠群養，十周后進(jìn)行行為學(xué)和生理測試。行為結果顯示:與群養組相比，單養組大鼠在曠場(chǎng)中的直立次數減少，明暗箱測試中的暗箱停留時(shí)間增長(cháng)，穿越次數減少;說(shuō)明長(cháng)期社會(huì )隔離使雌鼠產(chǎn)生了焦慮。雖然兩組大鼠與應激和生殖相關(guān)的生理器官重量沒(méi)有差異，但單養組血清皮質(zhì)醇和孕酮水平比群養組低，說(shuō)明長(cháng)期社會(huì )隔離導致雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸的調節異常，可能會(huì )對雌鼠的生殖生理帶來(lái)不利影響。

關(guān)鍵詞:社群隔離;雌性大鼠;焦慮行為;血液激素;生理指標

正常的社會(huì )關(guān)系對生物個(gè)體的健康有著(zhù)重要意義，一旦遭到破壞將對機體帶來(lái)消極影響。長(cháng)期社會(huì )隔離對群居動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一種生存應激。這種應激模型為研究人類(lèi)精神疾病提供了很好的切入點(diǎn)，被廣泛用于人類(lèi)精神障礙疾病的發(fā)病機制、新藥研發(fā)和預防等的研究。

社會(huì )隔離能使群居動(dòng)物腦的形態(tài)、激素水平以及神經(jīng)化學(xué)通路發(fā)生改變，進(jìn)而使該動(dòng)物表現出異常的行為和生理特征。以往研究發(fā)現長(cháng)期社會(huì )隔離會(huì )導致嚙齒動(dòng)物多動(dòng)，攻擊行為增加困，在新環(huán)境中缺乏正常的習慣化行為，前脈沖抑制(prepulse inhibition, PPI)缺失等。然而，社會(huì )隔離對嚙齒動(dòng)物的影響受到很多因素的制約，與被測動(dòng)物的性別年齡、品系以及隔離持續的時(shí)間均有關(guān)系。例如，社會(huì )隔離能使成年的雌性小鼠(M。musculus)'腎上腺肥大，動(dòng)情周期縮短，使成年雌性大倉鼠(Tscheskia triton)的卵巢和子宮增大，但是對雄性大鼠(Rattus norvegicus )、雄性小鼠(Musmusculus)}和成熟的大倉鼠則沒(méi)有影響;3周齡的雄性bong Evan大鼠隔離12周可以增加其對酒精的偏好，但是在成年期進(jìn)行隔離則不會(huì )出現此現象,最近的研究表明短期隔離或者每天隔離1h，持續四周會(huì )導致草原田鼠血清皮質(zhì)酮顯著(zhù)升高;但是長(cháng)期隔離四周則對血清皮質(zhì)酮沒(méi)有影響

社會(huì )隔離能否使鼠類(lèi)產(chǎn)生脅迫和應激反應，與鼠類(lèi)在自然條件下的生活方式也有密切關(guān)系少〕。研究表明單養對大鼠、小鼠和長(cháng)爪沙鼠( Merionesunguiculatus)等群居動(dòng)物會(huì )產(chǎn)生脅迫效應，引起焦慮反應而對營(yíng)獨居生活的金倉鼠(Mesocricetus auratus)和大倉鼠則是有利的關(guān)于社會(huì )隔離對大鼠應激反應的影響研究尚存在爭議，比如有些研究發(fā)現社會(huì )隔離引起大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno-('.orticotropic Hormone,ACTH)和皮質(zhì)酮的升高ya.zz爪有些研究中則是降低，還有些研究發(fā)現ACTH和皮質(zhì)酮的水平在群養和隔離飼養動(dòng)物之間差異不顯著(zhù)

在本研究中，我們將以成年雌性大鼠為研究對象，一定條件下，雌性的應激反應明顯高于雄性大鼠，但以往的社會(huì )隔離研究用雄鼠比較多，采用高架十字迷宮(elevated plus maze,  EPM)曠場(chǎng)(open field)和明暗箱(light/dark box) 3種經(jīng)典的焦慮測試方法來(lái)檢測長(cháng)期社會(huì )隔離(隔離l0周)能否引起雌性大鼠的焦慮反應;皮質(zhì)醇、孕酮、雌二醇等激素水平與群養組大鼠是否存在差別;應激、生殖相關(guān)的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺等器官重量是否發(fā)生了變化。本研究將有助于進(jìn)一步加深人類(lèi)對嚙齒類(lèi)動(dòng)物社會(huì )隔離焦慮模型的理解。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物

24只2個(gè)月齡成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始體重(196.3 ^-242. 6 g)，購買(mǎi)于北京維通牙日華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限公司?？紤]到雌性SD大鼠是褐家鼠的變種，在野外屬于群養動(dòng)物，在實(shí)驗前，4只雌鼠同籠飼養，買(mǎi)回后適應1周;每天進(jìn)行陰道分泌物的涂片，觀(guān)察動(dòng)情周期的變化，選擇有正常動(dòng)情周期的大鼠進(jìn)行后續實(shí)驗。飼養大鼠的房間的光暗周期是14I, / lOD，光周期逆轉(早晨08:00關(guān)燈，22:00亮燈)，室溫控制在(22士2)0C。整個(gè)實(shí)

驗期間，供給充足的食物和水，食物為標準大鼠飼料。實(shí)驗時(shí)，我們隨機將24只雌鼠分為兩組，其中12只四只同籠飼養，作為群養組，其他12只單籠飼養，作為社會(huì )隔離組。標準大鼠塑料飼養籠(37 cmX 26 cmX 17 cm)內連續飼養10周。

為了排除動(dòng)情對行為和激素結果的影響，我們只選用非動(dòng)情期大鼠的數據進(jìn)行統計分析。為了避免人為因素對大鼠行為和激素水平的影響，我們在大鼠的行為測試和取血樣之后檢查其陰道分泌物涂片，確定其動(dòng)情狀態(tài)。動(dòng)情期大鼠陰道分泌物全部是無(wú)核角質(zhì)化細胞或間有少量上皮細胞。

1. 2行為測試

所有的行為測試都是在光線(xiàn)較暗的安靜的房間進(jìn)行。測試時(shí)間為9:30-16:30(大鼠光周期的暗相)。行為測試時(shí)，按照高架十字迷宮、曠場(chǎng)和明暗箱的順序依次測定，每只鼠每天只進(jìn)行一次測試。

1. 2. 1高架十字迷宮 高架十字迷宮由上海欣軟信息科技有限公司提供，包括兩個(gè)開(kāi)放臂(45 cm X 10 cm)、兩個(gè)封閉臂(45 cm X 10 cm X40 cm)以及10 cm X 10 cm的中心區域，封閉臂和開(kāi)放臂交叉呈十字形，整個(gè)迷宮距離地而74 cm。被測大鼠在測試前先在測試的房間中適應30 min,測試時(shí)有正常的燈光照明。將被測大鼠放在中心區域(頭朝向開(kāi)放臂)，讓其自由探索5 min。每只大鼠在迷宮中的活動(dòng)情況由攝像機拍攝記錄，然后由對實(shí)驗處理不知情者對錄像進(jìn)行觀(guān)察，統計動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)放臂和封閉臂的次數(四肢均進(jìn)入臂內)，以及分別在開(kāi)放臂和封閉臂內停留的總時(shí)間。

1.2.2曠場(chǎng)   曠場(chǎng)由上海欣軟信息科技有限公司提供，大小為75 cmX 45 cmX 35cm的有機玻璃制成的箱子(無(wú)蓋)，將其底板平均劃分成15個(gè)15 cm X 15 cm的格子，中間的3個(gè)方格稱(chēng)為中央格。實(shí)驗開(kāi)始時(shí)，將被測鼠輕輕放在曠場(chǎng)一角的格子中(朝向角落)，讓其自由探測10 min，攝像機記錄其在此時(shí)間段內的所有行為。統計的指標如下:水平運動(dòng)能力(所穿越的格子數)、直立次數(后肢站立，前爪騰空或扶趴曠場(chǎng)壁的次數)、中心時(shí)間(在中心格中停留的時(shí)間)以及潛伏期(從放入到第一次離開(kāi)角落格子的時(shí)間)和休息時(shí)間(四肢站立不動(dòng))。

1.2.3明暗箱  明暗箱由上海欣軟信息科技有限公司提供，由兩個(gè)規格為35 cm X 25cm X 17 cm的塑料箱組成，中間通過(guò)錫鐵皮管(長(cháng)5cm，直徑為5. 5 cm)相連。其中一箱用透明的有機玻璃板覆蓋，并在盒蓋上方30 cm處放置40 W的燈泡提高亮度，作為明箱;另一箱則用硬紙板密封，阻比光線(xiàn)進(jìn)入，作為暗箱。測試時(shí)，將待測鼠放入明箱的中心區域，任其在明箱和暗箱中自由探究5min。所統計的參數包括:潛伏期(從放入到第一次離開(kāi)明箱所需要的時(shí)間)，明箱中累積時(shí)間、暗箱中累積時(shí)間(四肢均進(jìn)入時(shí)，認為是進(jìn)入)和兩箱之間的穿越頻次。

每只動(dòng)物測試完畢，實(shí)驗人員都對所使用的迷宮進(jìn)行擦拭清洗(先用75%的酒精，然后用水)，并用吹風(fēng)機吹干，以避免前一只大鼠的遺留氣味影響

之后待測大鼠的焦慮行為水平。

1. 3器官解剖和血液激素的測定

處理10周后，在上午9: 30-10: 00，采用斷頭的方法處死兩組試驗鼠,3 min內收集軀干血。血樣在4 000 r/min, 4℃下離心30 min，取得血清。將血清保存在一2 0 0C，以備進(jìn)行皮質(zhì)醇、孕酮和雌二醇的測定。然后，解剖大鼠的腎上腺、脾臟、卵巢、子宮和包皮腺并稱(chēng)重，精確到0. 1 mg。相對器官重量通過(guò)下而的公式計算相對器官重一絕對器官重(g) X100/體重(g) 0血清樣品的激素含量采用Iz} 1放射性免疫測定的方法進(jìn)行測定。激素測定所用的試劑盒均由北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供。人類(lèi)的抗血清具有高度特異性;對所有標準的激素來(lái)說(shuō)，人類(lèi)抗血清與其他的類(lèi)固醇激素發(fā)生交叉反應的可能性小于0.0100;內部和相互反應的可變性小于7. 4%和10. 0%。

1. 4數據分析

首先要采用單樣本KS檢驗法對所測得的數據進(jìn)行正態(tài)性檢驗。對于正態(tài)分布的數據，采用雙尾獨立樣本T檢驗;對于非正態(tài)分布的數據，則采用Mann Whitney U檢驗進(jìn)行統計分析。所有數據都用SPSS 18. 0進(jìn)行統計分析，顯著(zhù)水平定為a=0. 05。

2結果

2 .1高架迷宮實(shí)驗

隔離飼養和群養大鼠在高架十字迷宮測試中的行為沒(méi)有表現出顯著(zhù)差異(表m1)

2. 2曠場(chǎng)實(shí)驗

與四只一籠的群養雌鼠相比，單養的雌鼠在曠場(chǎng)中直立次數明顯減((t=2.543,P=0.023)，其他行為沒(méi)有顯著(zhù)差異。中間格子的停留時(shí)間是情緒的重要指標，雖然從平均值來(lái)看，兩者有較大差別，但數據是非正態(tài)分布，采用Mann Whitney U檢驗進(jìn)行統計分析，結果顯示群養組和單養組之間并沒(méi)有顯著(zhù)差異(二=0.221,P=0.833)(表2)

2. 3明暗箱實(shí)驗

與群養的雌性大鼠相比留時(shí)間顯著(zhù)增多(Ct= 2. 520,留時(shí)間顯著(zhù)減少(Ct一2. 524,，單養雌鼠在暗箱中停P = 0. 047)，明箱中停P = 0. 045)，在明暗箱之間穿越次數明顯減少(總穿越頻次:t = 2. 114,P=0. 049)，潛伏期沒(méi)有差異(二=1.629,P=0.103)(表3)。

2. 4體重和器官重量變化

單養和群養雌性大鼠的試驗前初始體重沒(méi)有顯著(zhù)差異((t=1.290,P=0.210)，但隔離飼養

第1周后，與群養組大鼠相比，單養組大鼠表現出明顯的體重增加(t=2. 570,P=0. 023)，這種

差異一直持續到隔離飼養的第10周(t=2. 900,P=0 .050)(圖1)。

然而，單養和群養雌鼠之間腎上腺、脾臟、子宮、卵巢和包皮腺的相對重量并沒(méi)有表現出顯著(zhù)差異結果見(jiàn)表40

我們的研究結果表明長(cháng)期社會(huì )隔離使雌性大鼠在曠場(chǎng)中的直立行為減少，在明暗箱測試中，明箱和暗箱之間穿越次數減少，并在暗箱中停留時(shí)間增加，說(shuō)明雌性大鼠在長(cháng)期社會(huì )隔離中產(chǎn)生了焦慮行為。這與有些早期的研究結果一致。但Helleman與Zha等的研究結果卻表明社會(huì )隔離并沒(méi)有使大鼠產(chǎn)生焦慮反應。這種差異原因可能是實(shí)驗動(dòng)物品系、性別差異及實(shí)施隔離的時(shí)間不同引起的。比如，Hellemans用的是雄性I, Evan大鼠，而本實(shí)驗選用的是雌性SD品系的大鼠;Hellemans選擇在Long-evans大鼠21 d和66 d

時(shí)進(jìn)行隔離，共隔離飼養了3個(gè)月，Zhao是在SD大鼠21天時(shí)實(shí)施的隔離，共隔離飼養了8周，而本實(shí)驗則是在SD大鼠成年的時(shí)候進(jìn)行的隔離，共隔離飼養了10周。根據以前文獻報道，社會(huì )脅迫通常會(huì )減少動(dòng)物在高架迷宮中開(kāi)放臂停留的時(shí)間X33 3d}但令人費解的是，在高架十字迷宮測試中，我們并沒(méi)有觀(guān)察到隔離大鼠和群養大鼠在行為上的差異。這可能由于高架十字迷宮中的行為參數比較容易受到各種不確定測試因素的影響所致，3}};但也可能由于成年SLl雌性大鼠對曠場(chǎng)和明暗箱測試更加敏感，具體原因還有待進(jìn)一步的驗證。

體重方而，我們發(fā)現與群養大鼠相比，社會(huì )隔離僅一周就能使雌性大鼠的體重顯著(zhù)增加。這可能是因為隔離飼養的大鼠比群養的大鼠進(jìn)食量更大，有研究表明，即使己經(jīng)飽食的隔離飼養大鼠仍然表現出取食行為。另一方而，體重的增加(肥胖)也是判斷嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生社會(huì )脅迫的一個(gè)重要指標

除了體重增加之外，應激、生殖器官重量及相關(guān)激素水平的變化也是動(dòng)物產(chǎn)生脅迫反應比較直觀(guān)的測量指標[?17。但在我們的試驗中，群養組與單養組的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺的相對重量并沒(méi)有表現出差異。這可能是因為稱(chēng)量器官濕重很容易受到血液含量及附帶組織的干擾。激素的研究結果表明社會(huì )隔離使血清中皮質(zhì)醇和孕酮降低，表明社會(huì )隔離導致了雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體Jh}腺軸的調節異常，可能會(huì )影響到隔離鼠的代謝、繁殖和免疫等生理功能。我們雖然發(fā)現社會(huì )隔離使雌性大鼠出現了明顯的焦慮行為，但皮質(zhì)醇卻顯著(zhù)下降，這種行為和激素水平不一致的現象，以往研究中也有出現，比如:高熱應激使大鼠焦慮，然而血清皮質(zhì)酮的水平卻下降.當糖皮質(zhì)激素水平是正常的時(shí)候，大鼠也常會(huì )出現各種焦慮行為口;創(chuàng )傷后應激會(huì )導致行為和神經(jīng)活動(dòng)的改變，但尿液中皮質(zhì)醇水平卻降低比〕。這或許是因為焦慮行為和激素水平測試的結果非常依賴(lài)動(dòng)物的飼養條件(活動(dòng)空間大小、飼料)、測試環(huán)境及選擇的測試方法(依靠單一行為方法無(wú)法準確推斷實(shí)驗動(dòng)物的焦慮水平);還有可能由于動(dòng)物對長(cháng)時(shí)期的應激刺激產(chǎn)生了適應;另外，雌性大鼠的激素水平可能與其所處的動(dòng)情周期也有關(guān)系。

4結論

本文研究結果表明，社會(huì )隔離使雌性成年大鼠產(chǎn)生了焦慮行為，并引起隔離大鼠血液中皮質(zhì)醇和孕酮的下降;動(dòng)物長(cháng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的獨居或居的生活方式是決定動(dòng)物馴化過(guò)程中適宜養殖條件的重要因素，人為改變其生活模式可能會(huì )對其行為和生理產(chǎn)生影響。此研究結果將有助于進(jìn)一步加深人類(lèi)對嚙齒類(lèi)動(dòng)物社會(huì )隔離焦慮模型的理解。本研究的局限性在于激素和行為的檢測雖然排除了動(dòng)情期大鼠，但沒(méi)有認真區分其他動(dòng)情周期比如動(dòng)情間期、動(dòng)情前期和動(dòng)情后期之間的差別。社會(huì )隔離對處于不同動(dòng)情狀態(tài)雌鼠的影響尚需要進(jìn)一步研究。

閱讀：  2016-05-30 14:38:53