⒈ 配膠緩沖液系統對電泳的影響？
在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導電性與電場(chǎng)強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓梯度，壓著(zhù)蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。
所以，pH對整個(gè)反應體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應首要考慮該因素，當然其他的因素也可以從多方面考慮。
⒉ 樣品如何處理？
根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。
1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。
2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。
3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來(lái)使用。
⒊ SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris－HCl系統，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。
⒋ 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著(zhù)的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。
⒌“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。
處理辦法：待其充分凝固再作后續實(shí)驗。
⒍ “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？
主要出現在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。
⒎ 為什么帶出現拖尾現象？
主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。此外可能是灌膠時(shí)分離膠過(guò)多導致濃縮膠很少，不能起到濃縮作用，沒(méi)有把樣品壓成一條線(xiàn)。
處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(cháng)，重新配制；降低凝膠濃度；灌膠時(shí)分離膠不要過(guò)多。
⒏ 為什么帶出現紋理現象？
主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。
⒐ 什么是“鬼帶”，如何處理？
“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì )出現在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應中可見(jiàn)其能與目標條帶對應的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。
⒑ 為什么溴酚藍不能起到指示作用？
我們在實(shí)驗中常會(huì )遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。
處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。
⒒ 為什么電泳的條帶很粗？
電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。
處理辦法：適當增加濃縮膠的長(cháng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當降低電壓；
⒓ 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？
這種現象一般初學(xué)者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒(méi)有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過(guò)少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。
處理辦法：電泳槽正確裝配即可。
⒔ 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？
這主要出現在初學(xué)者中，一般對電泳不會(huì )有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。
⒕ 凝膠時(shí)間不對，或慢或快，怎么回事？
通常膠在30MIN-1H內凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用，TEMED不穩定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。
⒖ 電泳時(shí)間比正常要長(cháng)？
可能由于凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地PH選擇錯誤，即緩沖系統地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統的離子強度太高。
⒗分離膠加上后為什么要立即加水？
加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線(xiàn)上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
⒘連續分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長(cháng)度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml
尿 素20--50g
10×TBE緩沖液8ml
30%丙烯酰胺10ml
APS（過(guò)硫酸銨）500--800ul [注：現配現用]
TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul
閱讀： 2016-04-25 14:23:53
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