①切膠回收DNA片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相對比較薄的膠來(lái)跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續麻煩。

②主要還是DNA的濃度, 如果DNA濃度不夠, 想膠小點(diǎn)也不可能。

③紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無(wú)DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。

④利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個(gè)原因：膠塊未完 全溶解，可適當延長(cháng)水浴時(shí)間，并增加上下顛倒次數輔助溶解；膠塊體積太大，應先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結合 DNA，如pH太高，應作適當調整；漂洗液中未加入無(wú)水乙醇。

⑤可以改用去離子水洗脫。但是實(shí)驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當調高其pH 值，以增加洗脫得率。

⑥洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會(huì )影響后續酶切實(shí)驗，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見(jiàn)回收 效率低的解決方案。

⑦不可以使用更小洗脫體積（小于說(shuō)明書(shū)提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因為說(shuō)明書(shū) 提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來(lái)。

⑧電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續實(shí)驗對片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。

⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過(guò)久， 使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或將膠塊保存在4℃或-20℃；制膠的電泳緩沖液濃度過(guò)高或陳舊。

關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項

1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話(huà)就是保證切下的帶沒(méi)有外源dna污染。
2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。
3. 關(guān)于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果戴樹(shù)脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來(lái)確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。
4. 按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已 知，根據尺子來(lái)衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺(jué)得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。

膠回收

一. 提高膠回收量的辦法：

1) 增加電泳時(shí)的上樣量。

2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。

3) 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。

4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無(wú)論多大的體積都用一個(gè)管子，轉移到同一個(gè)柱子上。

5) 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過(guò)一般不要多余750ul。

6) 膠回收的關(guān)鍵是通過(guò)柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好 的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。

7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。

最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無(wú)法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結合在 膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過(guò)夜，第二天再離心回收，效果不錯。

10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。

二. 幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟

1) 普通膠回收

如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀 即可。另外好像還有冷凍法，沒(méi)作過(guò)，不是很清楚。

2) 從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA

純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混 勻），12000rpm，3分鐘離心。反復1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無(wú)水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將 純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結構分析，探針制備等）。

3) 擴增特異性好的PCR回收

如果PCR擴增特異性好，只是簡(jiǎn)單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀回收。

三. 不需膠回收就可直接連接的方法

1) 低溫冷凍析出法

跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒(méi)有脫氧 核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負75度冰箱中10－30分鐘，接著(zhù)1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在 另一個(gè)管子中，做好標記，放在－20度備用。

2) 酶切后的直接連接

在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的.

四、一些注意事項

1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話(huà)就是保證切下的帶沒(méi)有外源DNA污染。

2.切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。

3.關(guān)于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果你戴樹(shù)脂眼鏡就可以了。

4.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用 柱子的話(huà)）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。

5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過(guò)夜浸泡，即可。當然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標記的探針用X片，未標記的用 EB。

6.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。

7.參照分子克隆 用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

附注：

1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：

1)DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超 螺旋>線(xiàn)性DNA）

2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA

Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb

1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.

3)DNA構象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線(xiàn)狀DNA>單鏈開(kāi)環(huán)。當條件變化時(shí)，情況會(huì )相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及 EB含量有關(guān)。

4)所加電壓：低電壓時(shí)，線(xiàn)狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過(guò)5V/cm

5)堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃

6)嵌入染料的存在：降低線(xiàn)性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)

7)電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無(wú)離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強度過(guò)大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用 1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應戴手套，盡量減少臺面污染。

3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

閱讀：  2016-04-15 13:38:18