問(wèn)：想從酵母提取質(zhì)粒，轉化大腸桿菌，按分子克隆的方法，可能都線(xiàn)性化了，轉化率為0，請問(wèn)有什么好的辦法？

答：以下是我的方法，曾提過(guò)數百個(gè)，好像轉化效率還可以,基本上都提出來(lái)了。

個(gè)人體會(huì )是Lyticase的活性要好，而且渦流混勻這一步好像要盡量充分吧，u see，酵母質(zhì)粒所以不好提，就是因為酵母細胞有很厚的細胞壁，再加上酵母質(zhì)?？截悢的慷嗌俚膯?wèn)題，所以破壁一定要充分。其次嗎？感受態(tài)細胞的狀態(tài)也會(huì )有很大的影響……再有，如果擔心酵母細胞的活性問(wèn)題，也可以活化一下再提，不過(guò)好象我的實(shí)驗中這項不是問(wèn)題.......哈哈….

詳細步驟：

1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml離心管中。

2、每管加10μl的裂解液（Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存），渦流混勻。

3、37℃，200-250r/m，30-60min。

4、每管加10 μl 20％SDS，渦流1min。

5、–20℃凍存過(guò)夜。

6、室溫下融解后，渦流混勻。

7、質(zhì)粒提取。
　　7.1  1.5ml離心管加TE Buf至200μl的（pH7.0）
　　7.2  200μl酚,渦流5min后，4℃，14000r/m離心10min。
　　7.3  取上清至干凈的1.5ml Eppendorf管中。
　　7.4  等體積酚氯仿，渦流5min。
　　7.5  4℃，14000r/m離心10min。
　　7.6  取上清至一干凈的1.5ml Eppendorf管后加等體積氯仿，渦流混勻。
　　7.7  4℃，14000r/m離心10min。
　　7.8  取上清至一干凈的1.5ml Eppendorf管中。
　　7.9  8μl 10M NH4Ac和500μl 95％～100％的乙醇。
　　7.10  –70℃，1h。
　　7.11  4℃，14000r/m離心10min。
　　7.12  棄上清，空氣中干燥。
　　7.13  10μl H2O懸浮細胞。

8、轉化（要求：4℃預冷）
　　8.1  冰上融化感受態(tài)細胞（感受態(tài)細胞的制備見(jiàn)分子克隆啦）Top10f’。
　　8.2  加100μl轉化細胞到預冷的1.5ml離心管中，槍頭輕輕吹打混勻。
　　8.3  冰上孵育30min。
　　8.4  42℃，45S～50S。
　　8.5  冰上孵育2min后，加1ml LB。
　　8.6  37℃，1h，250r/m.
　　8.7  2500r/m，5min，RT。
　　8.8  棄上清，在剩余的溶液中懸細胞。
　　8.9  接種LB/Amp板，37℃，倒置培養24h。

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閱讀：  2016-04-15 11:43:59