一、目的與意義
學(xué)習使用大腸桿菌感受態(tài)細胞導入外源DNA，使學(xué)生掌握DNA分子進(jìn)入細胞的原理和實(shí)驗操作技術(shù); 掌握PCR法快速鑒定重組載體的基本操作。
二、實(shí)驗原理
轉化是指將質(zhì)粒DNA或構建的重組子導入細胞的過(guò)程。細菌細胞在低溫，低滲（CaCl2溶液）中膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面。經(jīng)42℃短時(shí)間熱激處理后，促進(jìn)了細胞吸收DNA復合物。重組質(zhì)粒轉化宿主細胞后，還需要對轉化菌落進(jìn)行篩選鑒定，通過(guò)α互補進(jìn)行篩選是最常用的鑒定方法之一。
目前實(shí)驗使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結構稱(chēng)為lacZ基因。lacZ 基因編碼的α肽鏈與失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突變體互補，產(chǎn)生具有功能活性的β半乳糖苷酶分子，這種現象稱(chēng)為α互補。在IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）的誘導下，β半乳糖苷酶能將X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和藍色的底物5-溴-4-靛藍。因此，任何攜帶lacZ基因的質(zhì)粒載體轉化到β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，都會(huì )在涂有IPTG和X-Gal的培養基平板上形成藍色菌落。當有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位點(diǎn)后，就破壞了α肽鏈的閱讀框，從而無(wú)法形成α互補，不能產(chǎn)生具有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重組子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培養基平板上是白色菌落。
PCR法快速鑒定重組載體的基本原理是直接用菌液為摸板，通過(guò)特異引物的擴增來(lái)鑒定外源片段是否重組。
三、實(shí)驗儀器 PCR技術(shù)討論版  http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html

四、實(shí)驗材料
1、1.5 ml離心管
2、無(wú)菌槍頭20 μL各2支
3、PCR管
五、實(shí)驗試劑
1、溴酚蘭加樣緩沖液（6×）: 溴酚蘭0.25%，蔗糖40%
2、溴化乙錠（10 mg/ml）
3、5×TBE：Tris 堿54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na2·2H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 ml。高壓濕熱滅菌20 min，4℃保存備用。用前稀釋至0.5×。
4、PCR所用試劑同
5、dNTP Mix (上海生工)
6、Taqase plus（北京鼎國）
7、模板DNA：20 ng/µL
8、引物（委托上海生工合成，經(jīng)離心，用無(wú)菌ddH2O稀釋成20 nmoI/L

9、10×Taqase plus緩沖液
10、無(wú)菌ddH2O
 

閱讀：  2013-10-15 17:19:28