1.如何測定引物的OD值？

用紫外分光光度計在260nm波長(cháng)測定溶液的吸光度來(lái)定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時(shí)溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會(huì )有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進(jìn)而可以計算出母液的OD值。
舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說(shuō)明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說(shuō)明原來(lái)1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎樣溶解引物？

我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實(shí)驗需要加入適量的無(wú)核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開(kāi)啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘 的轉速下離心1分鐘，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失。

3.合成的引物應如何保存?

沒(méi)有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會(huì )降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進(jìn)行實(shí)驗。

4.如何檢測引物的純度？

實(shí)驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個(gè)堿基的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后(約2-3小時(shí))，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的(有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì )有條帶，乃是引物二級結構條帶)。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團嗎?

沒(méi)有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時(shí)請特別注明，此時(shí)需收取磷酸化的費用。

6.合成的引物進(jìn)行PCR反應時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦?

PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。
1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結構.
3) PCR反應用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應條件是否合適?
如果一切正常，還無(wú)法解決問(wèn)題時(shí)，我們可以免費重新合成引物。

7.測定了引物的OD值后發(fā)現A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?

由于核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強吸收，從生物體內提取核酸時(shí)，常用A260/A280比值來(lái)評價(jià)核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個(gè)堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數不同，因此不同堿基構成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì )大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來(lái)判斷引物的純度.

8.如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？

用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應？ 一般來(lái)講，20個(gè)堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。 15.引物在常溫下運輸，會(huì )降解嗎？ 不會(huì )降解，干燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì )降解。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數混合，總體積不要超過(guò)500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。

9.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現有很多條泳帶，為什么?

對引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復雜的立體結構，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現多條泳帶，更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。

10.能否根據引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進(jìn)行定量?

不能。因為EB是通過(guò)嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著(zhù)色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過(guò)自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結構或鏈間形成部分雙螺旋結構，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據EB染色帶的亮度來(lái)對合成的DNA進(jìn)行定量。

11.2OD的引物可以多少做次PCR反應？

一般來(lái)講，20個(gè)堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。
12.引物在常溫下運輸，會(huì )降解嗎？
不會(huì )降解，干燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì )降解。

13: 合成的熒光標記探針應如何保存?

1.熒光探針必須避光保存。
2.干品請于-20℃保存。
3.強烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩定，保存時(shí)間更長(cháng)。通常，將探針配制成100 pmol/ul的儲備液，分裝成幾份 (避免反復凍融)，于-20℃保存。使用前，將配制好的儲備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

14: 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長(cháng)度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

1.A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
2.DNA的立體結構不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長(cháng)鏈Oligo DNA之間差別較小。

15: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現，引物處的堿基有錯誤，為什么?

如果測序后引物處出現了問(wèn)題，不排除PCR錯配的可能，但更主要的原因應在合成引物本身。在引物合成過(guò)程中，除了人為將序列輸錯 (可核對合成報告單)，化學(xué)合成方法本身不可避免地會(huì )產(chǎn)生失敗序列，具體分析如下：
1.由于DNA合成是從3′→5′端一個(gè)堿基一個(gè)堿基地連接上去的，每連接上一個(gè)堿基，都需要多步化學(xué)反應 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱(chēng)之為一個(gè)循環(huán)。Coupling是上一個(gè)堿基的5′OH 與下一個(gè)堿基的3′活性部分發(fā)生偶聯(lián)反應，該反應的效率最高可達99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過(guò)Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；
2.Capping是將沒(méi)有連接上下一個(gè)堿基的5′-OH乙?；?，阻止其進(jìn)一步延伸。Capping的效率不可能達到100%，沒(méi)有被Cap的5′OH會(huì )進(jìn)一步發(fā)生反應，造成中間缺堿基的失敗序列；
3.Detritylation是將上一個(gè)堿基5′OH上的保護基脫掉，準備連接下一個(gè)新堿基，脫保護的效率也很難達到100%，沒(méi)有脫保護的5′OH會(huì )跳過(guò)該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；
4.在Coupling步驟中，新堿基(活性狀態(tài))在沒(méi)有與上一個(gè)堿基發(fā)生偶聯(lián)反應前發(fā)生自身連接，造成多堿基的失敗序列；
5.合成時(shí)堿基G可能會(huì )轉化成烯醇式異構體，PCR擴增時(shí)被DNA聚合酶識別作A，發(fā)生 G到A的轉換。
上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過(guò)純化不同程度地得到去除。對40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是PAGE；而對40 mer以上的DNA制品PAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇PAGE純化或HPLC純化的引物。

16: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現，引物處的堿基有錯誤，怎么辦?

1.因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請重新挑選一個(gè)克隆測序，會(huì )得到正確的結果。
2.如果挑選2 ~ 3個(gè)克隆測序情況還沒(méi)改觀(guān)，我們會(huì )免費重新合成引物。

17: 進(jìn)行蛋白表達實(shí)驗數個(gè)月不成功，后經(jīng)測序發(fā)現引物處有錯誤，怎么辦?

1.表達實(shí)驗之前一定要對DNA序列進(jìn)行驗證。
2.我們可以免費重新合成引物。
3.如進(jìn)行索賠時(shí)，按國際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內。

18: G到A的轉換。 上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過(guò)純化不同程度地得到去除。對40 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?

1.合成Oligo DNA時(shí)，選用高純度級制品。
2.避免使用過(guò)長(cháng)的Oligo DNA，最好選用小于35 mer的合成DNA制品。
3.進(jìn)行克隆實(shí)驗時(shí)，每次克隆都須進(jìn)行測序驗證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗。進(jìn)行蛋白表達實(shí)驗時(shí)，尤其需要注意。

19: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?

由于一般的PCR用引物的5′末端都沒(méi)有磷酸基團，因此，擴增后的PCR產(chǎn)物的5′末端也沒(méi)有磷酸基團。當克隆于去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，無(wú)法克隆進(jìn)去；而當克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，背景會(huì )極高。此時(shí)請對PCR產(chǎn)物的5′端進(jìn)行磷酸 (PO4修飾) 化處理。

20: 進(jìn)行反義核酸實(shí)驗時(shí)，是否要對DNA鏈全部進(jìn)行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內的穩定性?

DNA經(jīng)S代修飾后比較穩定，在細胞中不會(huì )被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩定性，但會(huì )降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數個(gè)(通常3個(gè))S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩定性，又能增加反義DNA與靶序列的結合能力。不過(guò)如果要將反義DNA注入到活的動(dòng)物體內，為增強穩定性，還是將整條鏈S代效果更好。
2’ O-Me (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。 此外，5-Me-dC由于能增強DNA雙螺旋的穩定性，有時(shí)也被摻入到S代的反義核酸中。 RNA也阻抗核酸酶降解，可與S代DNA構成嵌合的反義核酸，這樣既能增強反義核酸的穩定性，又能增加其與靶序列的親和性 (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。
此外，5-Me-dC由于能增強DNA雙螺旋的穩定性，有時(shí)也被摻入到S代的反義核酸中。

21: FITC、6-FAM、5-FAM標記之間有何區別?

它們皆是熒光素標記 (Fluorescein)，三者結構間的區別如下：
從結構圖可見(jiàn)，5-FAM與6-FAM互為異構體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團均為熒光素，通常使用中沒(méi)有區別。

22: 淬滅基團為T(mén)AMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標記熒光探針在使用上有什么不同?

由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記熒光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱(chēng)"TaqMan"探針，用于Real Time PCR實(shí)驗。由于這些淬滅染料的光譜學(xué)性質(zhì)不同(見(jiàn)下圖)，作為淬滅基團使用時(shí)的特點(diǎn)也不同，現說(shuō)明如下：
1.TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時(shí)，自身會(huì )在更高波長(cháng)處發(fā)射熒光，此發(fā)射熒光會(huì )對報告基團的檢測造成影響，探針熒光本底 (Background)相對較高。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團，但自身不發(fā)射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測靈敏度更高。
2.淬滅基團對報告基團的淬滅有賴(lài)于二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報告基團的熒光光譜應與淬滅基團的吸收光譜相交搭。對比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見(jiàn)TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團種類(lèi)比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報告基團種類(lèi)很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類(lèi)更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標記熒光探針用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

23: TaqMan 探針設計時(shí)應遵循哪些原則?

1.探針應位于兩引物之間；
2.探針中堿基G、C的含量應在20%～80%之間；
3.避免同種堿基成串出現，特別是堿基“G”；
4.堿基G不要出現在5’末端；
5.探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應在68～70℃之間；
6.探針長(cháng)度超過(guò)30個(gè)堿基時(shí)，最好把淬滅基團放在中間，以防止熒光本底過(guò)高，這時(shí)探針的3’末端應加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應過(guò)程中延伸。

24: 何謂分子信標 (Molecular Probes)？與普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什么特殊性？

Molecular Probes是一類(lèi)特殊的雙標記探針，通常狀態(tài)下，其兩末端互補配對，形成莖-環(huán)結構 (發(fā)卡環(huán)結構)，發(fā)卡環(huán)結構迫使分別連在兩末端的報告基團與淬滅基團緊密鄰近 (此時(shí)檢測不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報告基團與淬滅基團分開(kāi)，Molecular Probes變得明亮起來(lái)，可檢測到熒光。由于發(fā)卡環(huán)結構的存在，探針對靶序列檢測的特異性增強，相對于普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對SNP有更強的識別能力，能區分序列上僅相差一個(gè)堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測。此外，Molecular Probes也應用于活體細胞內的mRNA雜交、RNA加工、及轉錄過(guò)程的時(shí)時(shí)監測研究等。

閱讀：  2014-07-17 15:45:02