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本試劑盒僅供研究使用。

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料、魚(yú)、蝦和肉類(lèi)組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中氟蟲(chóng)腈殘留的定量檢測。

2 實(shí)驗原理

本試劑盒采用競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有氟蟲(chóng)腈偶聯(lián)抗原，加入氟蟲(chóng)腈標準品或樣品，游離氟蟲(chóng)腈與微孔條上預包被的氟蟲(chóng)腈偶聯(lián)抗原互相競爭抗氟蟲(chóng)腈抗體酶標記物， 用 TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色，用酶標儀在 450nm 波長(cháng)下進(jìn)行檢測， 吸光值與樣品中氟蟲(chóng)腈含量成反比，通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中氟蟲(chóng)腈的含量。

3 試劑盒組成

3.1 預包被的氟蟲(chóng)腈偶聯(lián)抗原的可拆酶標板：1 塊（12 孔×8 條）。

3.2 氟蟲(chóng)腈標準品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。

3.3 抗氟蟲(chóng)腈抗體酶結合物：1 瓶（6ml）。

3.4 顯色液 A：1 瓶（6ml）。

3.5 顯色液 B：1 瓶（6ml）。

3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。

3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。

3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

3.9 說(shuō)明書(shū)一份。

4 需要而未提供的材料

4.1 設備

4.1.1 波長(cháng)450nm酶標儀。

4.1.2 粉碎機。

4.1.3 量筒。

4.1.4 振蕩器。

4.1.5 漏斗。

4.1.6 Whatman No 1或相當的濾紙。4.1.7微量移液器。

4.2 試劑

4.2.1 去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5 貯存

5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應該密封干燥保存

6 注意事項

6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說(shuō)明書(shū)。

6.2 不要使用過(guò)期試劑盒。

6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。

6.4 標準品中含有氟蟲(chóng)腈，使用時(shí)應特別注意，操作時(shí)應帶手套。

6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6 不同標準品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì )影響試驗結果。

6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì )影響  實(shí)驗結果。

6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì )影響實(shí)驗結果

6.9 混合試劑時(shí)應避免起泡。

7 工作液準備

7.1 氟蟲(chóng)腈標準品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

7.3 顯色劑：已備用，避免光線(xiàn)直照

7.4 反應終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過(guò)程中，要嚴格按說(shuō)明書(shū)操作，提取過(guò)程中應準確稀釋?zhuān)駝t會(huì )出現結果不準確，樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1 取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2 強力振蕩3分鐘

8.3 用Whatman No 1濾紙過(guò)濾

8.4 取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應孔中（樣本稀釋倍數為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實(shí)驗須知

9.1.1 實(shí)驗開(kāi)始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)?；販刂潦?/span>溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度。

9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請不要改變分析程序

9.1.4 請使用精確的微量移液器

9.1.5 操作一旦開(kāi)始，請不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預先進(jìn)行編號，標記B0、標準品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測

9.2.2 取所需數量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

9.2.4 在B0孔中加入50μl 0.0ppb標準品溶液

9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗氟蟲(chóng)腈抗體酶結合物

9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應板幾秒鐘。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過(guò)程中不時(shí)輕拍反應板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應在吸水紙上拍打以完全除去孔中液  體。

9.4 反應

9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應板使之徹底混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結果在5min內讀取。

10 結果計算

10.1 定量分析

10.1.1 所獲得的每個(gè)濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標準（0標準）  的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

10.1.2 以氟蟲(chóng)腈濃度的對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線(xiàn)圖。根據樣品百分  吸光度值，可從曲線(xiàn)上得到對應點(diǎn)的橫坐標，即為氟蟲(chóng)腈濃度的對數值，求得反對數即為測定液中氟蟲(chóng)腈濃度C（ppb）

10.1.3 由于樣品經(jīng)過(guò)了預先稀釋?zhuān)虼烁鶕藴是€(xiàn)所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。

10.2 半定量測定

10.1.1 目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

10.1.2 儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

11 特異性

物質(zhì) 交叉反應氟蟲(chóng)腈 100%

12 試劑盒參數

本試劑盒檢測下限為0.05ppb B0吸光度最佳值應大于1.0

試劑盒吸光度板內誤差小于8％，板間誤差小于15％。用本說(shuō)明書(shū)提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。 13

試劑盒提供的標準曲線(xiàn)范圍為0.1ppb~8.1ppb。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽(yáng)性的樣品應該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。