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1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶等樣本中的磺胺類(lèi)藥物（SulfonamideS，SAS），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標準品或樣品溶液，樣本中的磺胺類(lèi)藥物和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類(lèi)藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類(lèi)藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線(xiàn)比較即可得出樣本中磺胺類(lèi)藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，45min～15min。
2.3 檢測下限：
組織（高檢測限方法）……………………0.5ppb
組織（低檢測限方法）……………………2.5ppb
血清、尿液………………………………2ppb
蜂蜜………………………………………0.5ppb
牛奶………………………………………10ppb
3 試劑盒組成
酶標板96孔
標準品（綠蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標準品（紅蓋）：1ml
抗體工作液（藍蓋）10ml
酶標記物（紅蓋）7ml
底物液A（白蓋）7ml
底物液B（黑蓋）7ml
終止液（黃蓋）7ml
20X濃縮洗滌液（透明蓋）40ml
2X濃縮復溶液（黃蓋）50ml
說(shuō)明書(shū)1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCL 、NaH2PO4·2H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
    實(shí)驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。實(shí)驗之前須檢查各種實(shí)驗器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗器具，以避免污染干擾實(shí)驗結果。
5.2 配液：
配液1：0.2M  NaOH溶液
    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解
配液2：0.02M  PB緩沖液
    稱(chēng)取2.58g Na2HPO4·12H2O和0.44g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。
配液3：0.5M鹽酸溶液
    4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。
配液4：乙腈-二氯甲烷混合液
    V乙腈：V二氯甲烷=1:4 
配液5：樣本復溶液
    2×復溶液在使用前按1：1用去離子水稀釋。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本（高檢測限）處理方法一
1）稱(chēng)取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入8ml乙腈-二氯甲烷混合液，振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min；
2）移取4ml上層清澈有機相至干燥容器中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；
3）加入1ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml?；旌?0s，15℃4000r/min以上離心5min；
4）去除上層正己烷，取20?l下層用于分析。  樣本稀釋倍數：1
5.3.2 組織樣本（高檢測限）處理方法二
1）稱(chēng)取3±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入3ml 0.02M PB緩沖液充分振蕩混勻，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振蕩10min，于15℃4000r/min以上速度離心10min；
2）移取2ml上層液體（約相當于1g的樣本）在50-60℃氮氣或空氣吹干； 
3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加入1ml樣本復溶液強烈振蕩1min，15℃4000r/min，離心5min； 
4）除去上層正己烷，取下層20?l用于分析。 樣本稀釋倍數：1 
5.3.3 組織樣本（低檢測限）處理方法
1）稱(chēng)2.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入8ml 0.02M PB緩沖液，震蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min； 
2）取20?l液體用于分析。樣本稀釋倍數: 5  
5.3.4 血清樣本處理方法 
1）將血樣本于室溫放置30min，于15℃4000r/min以上離心10min，分離出血清或過(guò)濾血清；
2）取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合，混合30s；
3）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數：4
5.3.5 蜂蜜樣本處理方法
1）稱(chēng)取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M 鹽酸 置于37℃環(huán)境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心10min；
3）取2ml上層液體于50℃下氮氣吹干，加0.5ml 已稀釋好的復溶液復溶，混合30s；
4）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數：1
5.3.6 尿樣本處理方法
1）用3ml 0.02 M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s； 
2）取20?l液體用于分析。  樣本稀釋倍數: 4 
5.3.7 牛奶樣本處理方法
1）取1ml牛奶樣本用0.02 M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋?zhuān)?0?l牛奶+380?l 0.02  M PB緩沖液），混合30s；
2）取20?l用于分析。  樣本稀釋倍數：20     
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì )有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗開(kāi)始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(gè)樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本20?l/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50?l，再加抗體工作液80?l/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應45分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50?l，再加底物液B 50?l，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50?l，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長(cháng)450/630nm）。測定應終止反應后在10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標準（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×100%
    A0    
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線(xiàn)的繪制與計算
    以標準品百分吸光率為縱坐標，對應的標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準品的半對數曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。