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一、檢測原理
本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被抗 硝基咪唑抗原。檢測時(shí)，加入標準品或樣品溶液，硝基咪唑抗體及酶標記物，包被抗原和加入樣本中的硝基咪唑競爭性地與硝基咪唑抗體結合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物，用TMB底物顯色；加入反應終止液，在450nm波長(cháng)酶標儀下進(jìn)行檢測，樣品中的硝基咪唑濃度與吸收光強度成反比。
二、檢測范圍
本試劑盒是應用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟、快速地檢測出蜂蜜中的硝基咪唑類(lèi)藥物。
四、試劑盒組成
酶標板1塊，96孔/板
標準液6瓶（綠蓋）：1ml/瓶
0 ppb、0.05ppb、0.2ppb、0.8ppb、3.2ppb、12.8ppb
高標準液1瓶（紅蓋）：100 ppb ………………1ml/瓶
抗體工作液 (藍蓋)………………………………7ml
酶標記物 (紅蓋)…………………………………12ml
底物液A (白蓋)……………………………………7ml
底物液B(黑蓋) ……………………………………7ml
終止液(黃蓋) ………………………………………7ml
20X濃縮洗滌液(透明蓋)…………………………40 ml
2X濃縮復溶液(黃蓋)……………………………50 ml
說(shuō)明書(shū)………………………………………………1份
五、 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
（1）設備
微孔板酶標儀(450nm)
振蕩器、離心機
微量移液器：20μl～200μl,100μl~1000μl
容量瓶：100ml，500ml，1000ml
試劑
    NaOH、無(wú)水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯
六、溶液的配制
    樣本前處理需配制：
配液1：pH 10.6   0.1M   碳酸鹽緩沖液
稱(chēng)取4.66g無(wú)水碳酸鈉，0.5g碳酸氫鈉去離子水500ml溶解。
配液2：2M 氫氧化鈉溶液
稱(chēng)取40g氫氧化鈉，加入去離子水500ml溶解。
配液3：復溶工作液
2X濃縮復溶液在使用前請按1：1稀釋?zhuān)渲瞥蓮腿芄ぷ饕骸?/span>
（1份濃縮復溶液+1份去離子水）
配液4：洗滌液
將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋。
20X濃縮洗滌液在使用前請按1：19稀釋?zhuān)?份濃縮洗滌液+19份去離子水）?？砂葱枧渲?，稀釋后的洗滌液可在4℃保存一個(gè)月。
七、樣本前處理方法
    樣本處理前須知
    處理任何樣本時(shí)，都須注意：
（1）實(shí)驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（2）實(shí)驗之前須檢查各種實(shí)驗器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗器具，以避免污染干擾實(shí)驗結果。
    樣本處理步驟：
蜂蜜（樣本稀釋倍數0.5）
（1）取3g蜂蜜，加3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至蜂蜜全部溶解；
（2）加入9ml 乙酸乙酯，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分，離心5分鐘；
（3）取上層有機相6ml至另一離心管中，加入2ml乙酸乙酯，2ml 2M氫氧化鈉溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分，離心5分鐘；
（4）取4ml清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，56℃水浴氮氣/空氣吹干；
（5）加入正己烷1ml，渦動(dòng)30s，再加入0.5ml復溶工作液混合30秒，室溫4000轉/分以上，離心5分鐘；
（6）去除上層有機相，取下層50?l液體用于分析。
八、酶聯(lián)免疫檢測步驟
測定前須知：
1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在使用中不要讓微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重復性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
5、在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線(xiàn)照射，用該板膜蓋住微孔板。
測定步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30分鐘，抗體不用在室溫下平衡，4℃取出立即點(diǎn)樣；每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均需做2個(gè)平行試驗。
2、加標準品/樣本50?l /孔，再加入抗體工作液50?l/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，4℃環(huán)境避光反應1小時(shí)。
3、洗板：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內液體甩干，加洗滌液 250l/孔，每次浸泡15~30秒，充分洗滌4－5次，用吸水紙拍干。
4、加酶標記物每孔100μl，用蓋板膜蓋好，25℃下避光反應30分鐘。取出酶標板，重復步驟3；
5、顯色：每孔先各加入底物液A 50μl，再各加入底物液B 50μl，輕輕晃蕩混勻，并在25℃下避光反應15分鐘。
6、讀數：每孔各加50μl終止液，在酶標儀于450nm處測定OD值（建議用450/630nm雙波長(cháng)檢測，在5分鐘內讀完數據）。
九、結果分析    
所測得的標準液或樣品吸光度的平均值（B）除以第一個(gè)標準液（0標準液）的吸光度（B0）值再乘以100%，得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝B/B0 ×100%
以標準品濃度的10為底的對數為X軸， 百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線(xiàn)。將樣本的百分吸光值代入標準曲線(xiàn)，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數，即為樣品中所含磺胺類(lèi)藥物的量。
利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。
十、試劑盒靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.05ppb
 樣本最低檢測限：
       蜂蜜樣本…………………………………………0.1ppb
回收率：
蜂蜜樣本 …………………………………………90±10%
精密度：
         試劑盒的變異系數均小于10%
十一、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）
會(huì )導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過(guò)程中如果出現板孔干燥的情況，則會(huì )出現標準
曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應
立即進(jìn)行下一步操作。
3、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。如不慎滴漏到皮
膚上，請盡快用水沖洗。
4、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì )引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
5、保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封
袋重新密封。標準物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。
6、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度（450nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
7、在加入底物液后，一般顯色15分鐘即可。若顏色較淺，可延長(cháng)反應時(shí)間到20分鐘（或更長(cháng)），但不得超過(guò)30分鐘。反之，則減短反應時(shí)間。
8、該試劑盒加標準品、抗體工作液的最佳反應溫度為4℃，加酶標記物與顯色步驟的最佳反應溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
十二、貯藏條件及保存期
貯藏條件：在2～8℃保存試劑盒
保存期：本試劑盒有效期為12個(gè)月。