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1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的鹽酸克倫特羅，試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標準品或樣品溶液，樣本中的鹽酸克倫特羅和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗鹽酸克倫特羅抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鹽酸克倫特羅含量成負相關(guān)，與標準曲線(xiàn)比較即可得出樣本中鹽酸克倫特羅的殘留量。

規格：96T/盒

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：  0.05ppb(ng/ml)
2.2 檢測下限：
尿液樣本……………………………… 0.05ppb
組 織（處理法一）…………………… 0.2ppb
組 織（處理法二）…………………… 0.05ppb
飼料樣本 ………………………………0.5ppb 
2.3 交叉反應率：
克倫特羅（Clenbuterol）  ……………… 100%
特普他林（Terbutalin）   ……………… <1%
馬布特羅(Mabuterol)     ……………… <1%
溴布特羅(Brombuterol)   ……………… <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） ……………… <1%
萊克多巴胺（Ractopamine）……………… <1%
3 試劑盒組成
酶標板………………………………96孔/板
標準液（綠蓋）：0 ppb、0.05ppb、0.15ppb、 0.45ppb、 1.35ppb、 4.05ppb…………………………………………各1ml    
高標準液（紅蓋）：100ppb………1ml
酶標記物 (紅蓋)…………………………7ml
抗體工作液 (藍蓋)………………………7ml
底物液A (白蓋)…………………………7ml
底物液B(黑蓋) …………………………7ml
終止液(黃蓋) ……………………………7ml
20X濃縮洗滌液(透明蓋)………………40 ml
10X復溶液(黃蓋)…………………………50 ml
說(shuō)明書(shū) …………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0?l-200?l，100?l-1000?l、多道300?l
4.3 試劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、甲醇、正己烷、無(wú)水硫酸鈉
5 溶液的配制
5.1 試驗前用去離子水將20X濃縮洗滌液稀釋成工作洗滌液。（19份離子水+1份20X濃縮洗滌液）
5.2 試驗前用去離子水將10X復溶液稀釋成工作復溶液。（9份離子水+1份10X復溶液）
5.3 0.1M HCl 溶液：取0.86ml濃HCl加去離子水至100ml。
5.4 0.1M NaOH 溶液：稱(chēng)取0.4g NaOH加去離子水至100ml。
5.5 乙腈-0.1M HCl 溶液：V乙腈:V 0.1 HCl =84:16
6 樣本前處理方法
實(shí)驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗結果。
6.1 尿樣本處理方法
    直接取50?l清亮尿樣進(jìn)行測定（渾濁尿樣需要過(guò)濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。
尿樣本稀釋倍數：1    檢測下限：0.05ppb
6.2 組織樣本處理方法一
   稱(chēng)取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50?l上清液進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數：4    檢測下限：0.2ppb
6.3 組織樣本處理方法二
稱(chēng)取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml乙腈-0.1M HCl，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min。
取上清液3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min，取全部上清在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥；
    加入1ml 復溶液混合振蕩30s，取50?l進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數：1    檢測下限：0.05ppb
6.4 飼料樣本處理方法
稱(chēng)取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無(wú)水硫酸鈉，振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；
吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮氣吹干，用1 ml復溶液溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min。
取50?l下層進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.5ppb
7 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì )有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
7.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(gè)樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
7.2 加樣反應：加標準品或樣本50?l/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50?l/孔，再加入50?l /孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。
7.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250?l/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7.4 顯    色：每孔加入底物液A 50?l，再加底物液B 50?l，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
7.5 終    止：每孔加入終止液50?l，輕輕振蕩混勻，終止反應。
7.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長(cháng)450/630nm）。測定應終止反應后在10分鐘內完成。
8 結果分析
8.1 百分吸光率的計算
    標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標準（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×100%
    A0    
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
8.2 標準曲線(xiàn)的繪制與計算
    以標準品百分吸光率為縱坐標，對應的標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準品的半對數曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。