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本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，在高鹽狀態(tài)下通過(guò)離心吸附柱特異性地結合溶液中的DNA，通過(guò)漂洗液將雜質(zhì)和其它成分去除，最后通過(guò)低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將高純度質(zhì)粒DNA從纖維素膜上洗脫。我公司采用進(jìn)口離心吸附柱，能高效、專(zhuān)一的吸附DNA。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于轉染多種細胞及各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接等實(shí)驗。

【使用說(shuō)明】

溶液 P2含SDS，在低溫條件下會(huì )產(chǎn)生沉淀，使用前放入37℃水浴幫助溶解，冷卻到室溫后使用。

每次使用前將溶液 P3 放在冰上預冷。

所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進(jìn)行離心，速度為12,000rpm (~13,400×g)。

【提取步驟】

 1、取2-4ml 過(guò)夜培養的菌液，12,000rpm 離心30秒，盡可能倒干或吸除上清，收集菌體。

選擇適量體積菌液，菌體過(guò)多會(huì )影響裂解致使提取的質(zhì)粒純度降低。培養基盡量除盡，殘留的培養基會(huì )降低質(zhì)粒提取效率。

2、加250μl溶液P1重懸菌體，劇烈渦旋振蕩至菌體完全散開(kāi)。

*未徹底混勻的菌塊，會(huì )影響細菌裂解，導致提取量和純度偏低。

3、加250μl的溶液P2（注意溶液P2是否有沉淀），上下翻轉5-8次使溶液充分混勻，室溫放置3-4分鐘。此時(shí)菌液應變得清亮、粘稠。

*溫和地上下翻轉充分混合，不要劇烈震蕩，以免基因組 DNA斷裂！

*如菌體過(guò)多，加入溶液P2后不清亮，可以適當補加P2（后續P3溶液也要按比例多加）。溶液P2反應時(shí)間不要超過(guò)5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。

4、加 350μl 溶液P3，立即溫和地上下翻轉5-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì )出現白色絮狀物質(zhì)。冰上靜置 3-5 分鐘，12,000rpm 離心10分鐘。

*加入溶液P3后應該立即充分混勻, 以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。

5、小心吸取上清，加入吸附柱 B 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

*吸取上清時(shí)要小心操作，寧可少吸一些體積也不能吸出沉淀，以免污染質(zhì)粒。

6、加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7、加入400μl 漂洗液WB, 12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。

8、將吸附柱放回空收集管中，12,000rpm離心60秒，盡量除去漂洗液。

*漂洗液中乙醇的殘留會(huì )影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實(shí)驗。也可以將吸附柱開(kāi)蓋，置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

9、小心取出吸附柱 ，放入一個(gè)滅菌的離心管中，在吸附膜的中間部位加 100μl 洗脫緩沖液EB-1或者EB-2（洗脫緩沖液事先在60-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置 2 分鐘，12,000rpm離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，再離心1分鐘。

*洗脫體積越大, 洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高, 可以適當減少洗脫體積,但是最小體積不應少于 50μl。

*本試劑盒提供兩種洗脫液EB和TE。EB（10mM Tris-HCl ，pH8.0），不含EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。如質(zhì)粒DNA需長(cháng)期保存，可以用TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）洗脫，EDTA可能影響下游酶切反應。